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基因細胞與Ⅰ型糖尿病

    摘要 目前ⅰ型糖尿病的基因治療領域取得眾多進展,如轉入凋亡基因異種胰島細胞 以阻斷免疫反應,通過各種策略將內分泌細胞系、肝細胞及成纖維細胞等經基因工程構建成能 分泌成熟胰島素的細胞,其分泌作用需受正常調控,本文對有關進展作以綜述。     
    ⅰ型糖尿病由胰島β細胞自身免疫破壞所致,常規治療是定期注射胰島素。然而血糖難 以達到功能良好的β細胞自然分泌胰島素的控制狀態,急性並發症(低血糖及酮症酸中毒)偶 爾發生,慢性並發症仍為威脅糖尿病患者的主要危險[1]。為建立內源性胰島素分泌系統,胰 腺或胰腎聯合移植已做了嘗試,但需長期免疫抑制治療,亦有較高的失敗率。從異體分離β細 胞移植也存在諸多缺陷,且胰腺供體有限。目前試圖替代人β細胞,首先利用異種胰島或β細胞系;其次是對非胰島素的細胞必需具有下列特性:
    ①表達gk和glut2;
    ②低表達高親和力的 已糖激酶(hk);
    ③表達激素原轉換酶pc2、pc3,能有效加工胰島素原成胰島素;
    ④能將胰島 素釋放到細胞外的分泌系統。然而僅β細胞具有所有這些特性,因而已探索對某些細胞進行改 造。
    1 細胞的基因工程構建 
    1.1異種胰島細胞胎豬胰島移植用於ⅰ型糖尿病具有較好的療效且取材便利,然而因排斥顯著療效難以持 久[2]。fasl受體表達在免疫細胞表面,fas-l與fas受體相互作用可誘導免疫細胞凋亡,故該 作用在維持免疫系統穩態及免疫耐受中發揮重要作用。lau研究顯示同時移植經基因工程處理 能表達fas配體(fasl)的肌纖維細胞,可明顯延長移植胰島細胞存活期。但半數以上的小鼠 仍在80天內移植物失效,部分由於肌纖維細胞停止表達fas-l\[3],如何使fas-l長期表達尚需 進一步研究。
    1.2 細胞株構建     
    β細胞類細胞系顯然是一類較符合生理的胰島替代物,經構建的細胞株可大量獲得。在 轉基因小鼠胰島細胞中定向表達sv40大t(sv40 large t)抗原可導致胰島素瘤,已作為細胞 株的來源[4]。這引起細胞對葡萄糖刺激的胰島素反應存在缺陷,表現為反應減弱或過強,可 能與葡萄糖感應器:葡萄糖磷酸化酶(gk)和葡萄糖轉運體(glut2)的表達異常有關[5]。同 時盡管未免疫隔離的細胞將被免疫系統殺滅,但這種永生型細胞移植於人體需要微包囊化。 
    1.3 神經內分泌細胞   
    早在1983年有人曾對神經內分泌細胞株(一種分泌acth細胞株,att20)作生物改造,用 病毒啟動子調控人胰島素cdna轉錄獲得初步結果。在胰腺特異性啟動子調控下gk基因可在att 20表達,用表達載體轉染後則表現出葡萄糖刺激的胰島素釋放[6]。正常的葡萄糖感應不僅需 要表達glut2,而且需要類似於正常β細胞的gk/hk活性比值[7]。最近有學者將胰島素原表達 載體直接導入nod小鼠的垂體間葉pomc分泌細胞,能大量分泌成熟胰島素,而這些細胞不受針 對胰島細胞的自身免疫破壞,將一定量的構建細胞移植於nod糖尿病小鼠,高血糖及糖尿病症 狀完全恢復,與胰島細胞自體移植相比,顯示分泌活性更高,再血管化更明顯[8]。 1.4 肝細胞     
經基因工程構建的外源型細胞株用於ⅰ型糖尿病存在各種障礙,已促使許多研究著眼於 內源性細胞。除胰島細胞外肝細胞是含有葡萄糖感應器(glut2及gk)唯一的體細胞,許多肝 髒特異性基因受生理性葡萄糖調控,故作為ⅰ型糖尿病基因治療的靶細胞尤為引人關注。然而 肝細胞不具備有葡萄糖控制胞吐作用的分泌顆粒,也無貯存分泌性蛋白的隔離區。當血糖升高 時,不會出現早相胰島素分泌。肝細胞也不具有切除c肽所需的激素原轉化酶(pc2和pc3), 故不能加工胰島素原分子[9]。因而,針對肝細胞作為分泌胰島素細胞存在上述缺陷,有關研 究不斷深入。valera在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(pepck)基因調控區控制下,得到表達人胰 島素原基因的轉基因小鼠,從肝細胞分泌的胰島素原具有生物活性,該動物呈現血糖正常且健 康善良好,經鏈脲佐菌素(stz)處理轉基因小鼠後,胰島素mrna水平較stz處理的非轉基因的 對照鼠增加,且血中c肽增加,血糖水平下降達40%[10]。     
    此外,肝腫瘤細胞亦可作為胰島素表達載體轉染的候選細胞,gros等將融合胰島素基因 構建於哺乳細胞的表達載體,其中含有人胰島素原基因(含有費林蛋白內切酶切點)及pepck 基因的啟動子片段,再轉染到大鼠肝腫瘤細胞,後經northern印跡、免疫組化及hplc分析顯示 90%胰島素原被加工成胰島素。胰島素分泌反應快速,經二丙基camp+地塞米松誘導15分鐘,胰 島素分泌量明顯增加,1小時內增加10倍,表現為內源性pepck基因表達受抑及葡萄糖攝取增加 [11]。若同時將人glut2基因轉染肝腫瘤細胞,胰島素分泌可受葡萄糖濃度調控[12]。 
    1.5 成纖維細胞及其它細胞     
    taniguchi用人胰島素原cdna轉染成纖維細胞(ltk細胞),人胰島素原分泌量達91ng/2 4小時/106細胞。這些細胞經半透膜(5%瓊脂糖膠)微囊化,體外研究顯示2×106微囊化的轉 染細胞能穩定產生胰島素原80余天(204.4±5.2ng/ml/天),若種植於stz糖尿病小鼠腹腔內 ,血糖恢復正常達30天[13]。另外,將表達胰島素原的質粒轉染成肌細胞,約50%胰島素原轉 化為胰島素,其分泌功能持續達1個月[14]。kuzume用胰島素原基因構建的腺病毒載體轉染到 293細胞,再植入胰腺全切的狗體內,與定期注射胰島素組相比,血糖維持正常且生存期明顯 延長,即使口服15g葡萄糖後血糖仍維持正常[15]。 
    2 細胞因子     
    tgfβ1能降調許多免疫反應,故有學者將表達tgfβ1載體轉染nod小鼠,tgfβ1水平較對 照組增加,遲發型超敏反應受抑制能保護具有自身免疫反應傾向的nod小鼠免於發生胰島炎或 糖尿病,相反轉入干擾素γ的nod小鼠早發糖尿病[16]。此外,血管內皮細胞生長因子(vegf )與新生血管形成有關,觀察顯示在糖尿病nod小鼠的缺血部位vegf水平下降,以致干擾側枝 循環形成,肌肉注射編碼vegf的腺病毒載體,可使nod糖尿病小鼠的vegf的腺病毒載體,可使 nod糖尿病小鼠的vegf水平及新生血管形成作用恢復正常[17]。 
    3 表達載體     
    腺病毒載體較適合體內基因轉導,其特點是產生的梯度高,能有效地把基因轉導入靜止 期細胞,遺傳信息保持其獨立可避免因插入性突變改變細胞基因型的危險。但可激發細胞免疫 ,甚至可針對導入基因[18],同時轉入基因表達時間有限,故不適宜ⅰ型糖尿病治療。缺陷型 重組逆轉錄病毒載體導入細胞後具有自我更新的特性,可長期表達。但產生滴度較低,且細胞 需處在增殖期,否則前病毒dna不易整合到染色體dna。     目前正研制新一代組合載體可克服上述不足,該載體是來自不同病毒成份及特性組合體 。woo用逆轉錄病毒將胰島素原基因導入大鼠肝髒,在病毒末端長重復序列的調控下,至少5% ~15%肝細胞被轉染,持續達6個月。若用stz處理大鼠,6天後均死於酸中毒,而在轉導2周後 在用stz處理轉基因大鼠,部分大鼠存活長達3周,但血糖水平類似於對對照鼠。提示來自於肝 細胞表達的胰島素原的活性可以防止肝糖原大量減少,脂肪蓄積及酮體產生,但其轉染效率尚 不能使血糖正常[19]。 
    4. 胰導素原加工的改進     
    正常時胰島素在β細胞分泌顆粒內加工為成熟胰島素需要激素原轉換酶pc2、pc3。但肝 細胞不能有效地加工胰島素原,故產生的胰島素原的生物活性較胰島素低。另有一種富含於肝 細胞的成對鹼性氨基酸蛋白酶(亦稱泛轉換酶或費林蛋白酶,furin),僅能識別鼠類胰島素 原的arg-x-lys-arg序列,不能有效加工導入的人胰島素原。為此,將furin序列引入人胰島素 原cdna的g-c、c-a結合點,再導入肝細胞即可分泌成熟胰島素[20]。因而,有學者將含有fur in識別序列的人胰島素原載體轉基因到小鼠肝髒,經高效液相色譜(hplc)分析顯示胰島素原 能有效地加工成胰島素分子[21]。 
    5 轉化效率     
    首先,page通過改進培養條件或加入肝細胞生長因子(hgf)能使80%小鼠肝細胞及40%人 肝細胞被轉導[22]。其次,亦可改進載體本身,一種組合病毒顆粒含有慢病毒(lentivirus, hiv1)可將前病毒基因組整合到非分裂期細胞內,高滴度制備逆轉錄病毒載體,利用vsv包被蛋 白作為病毒殼蛋白替代env基因產物,可轉導靜止期肝細胞β,極有可能成為ⅰ型糖尿病基因 治療的載體。 
    6 結語     
    綜上所述,要取代ⅰ型糖尿病的注射胰島素治療,移植能分泌具有生物活性胰島素的細 胞將是未來主要方向。然而,對細胞作基因工程以建立一種新型“β細胞”較為復雜,要作為 臨床治療手段,尚需進行許多改進得到更多的臨床驗證,此外,用細胞因子預防ⅰ型糖尿病或 血管並發症的臨床價值尚待探索。在此嶄新領域內治療糖尿病可靠方法能否脫穎而出,取決其 療效、安全、方便及費用。 
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