基因細胞與Ⅰ型糖尿病

    摘要 目前ⅰ型糖尿病的基因治療領域取得眾多進展，如轉入凋亡基因異種胰島細胞 以阻斷免疫反應，通過各種策略將內分泌細胞系、肝細胞及成纖維細胞等經基因工程構建成能 分泌成熟胰島素的細胞，其分泌作用需受正常調控，本文對有關進展作以綜述。     
    ⅰ型糖尿病由胰島β細胞自身免疫破壞所致，常規治療是定期注射胰島素。然而血糖難 以達到功能良好的β細胞自然分泌胰島素的控制狀態，急性並發症（低血糖及酮症酸中毒）偶 爾發生，慢性並發症仍為威脅糖尿病患者的主要危險[1]。為建立內源性胰島素分泌系統，胰 腺或胰腎聯合移植已做了嘗試，但需長期免疫抑制治療，亦有較高的失敗率。從異體分離β細 胞移植也存在諸多缺陷，且胰腺供體有限。目前試圖替代人β細胞，首先利用異種胰島或β細胞系；其次是對非胰島素的細胞必需具有下列特性：
    ①表達gk和glut2；
    ②低表達高親和力的 已糖激酶（hk）；
    ③表達激素原轉換酶pc2、pc3，能有效加工胰島素原成胰島素；
    ④能將胰島 素釋放到細胞外的分泌系統。然而僅β細胞具有所有這些特性，因而已探索對某些細胞進行改 造。
    1 細胞的基因工程構建 
    1.1異種胰島細胞胎豬胰島移植用於ⅰ型糖尿病具有較好的療效且取材便利，然而因排斥顯著療效難以持 久[2]。fasl受體表達在免疫細胞表面，fas-l與fas受體相互作用可誘導免疫細胞凋亡，故該 作用在維持免疫系統穩態及免疫耐受中發揮重要作用。lau研究顯示同時移植經基因工程處理 能表達fas配體（fasl）的肌纖維細胞，可明顯延長移植胰島細胞存活期。但半數以上的小鼠 仍在80天內移植物失效，部分由於肌纖維細胞停止表達fas-l\[3]，如何使fas-l長期表達尚需 進一步研究。
    1.2 細胞株構建     
    β細胞類細胞系顯然是一類較符合生理的胰島替代物，經構建的細胞株可大量獲得。在 轉基因小鼠胰島細胞中定向表達sv40大t（sv40 large t）抗原可導致胰島素瘤，已作為細胞 株的來源[4]。這引起細胞對葡萄糖刺激的胰島素反應存在缺陷，表現為反應減弱或過強，可 能與葡萄糖感應器：葡萄糖磷酸化酶（gk）和葡萄糖轉運體（glut2）的表達異常有關[5]。同 時盡管未免疫隔離的細胞將被免疫系統殺滅，但這種永生型細胞移植於人體需要微包囊化。 
    1.3 神經內分泌細胞   
    早在1983年有人曾對神經內分泌細胞株（一種分泌acth細胞株，att20）作生物改造，用 病毒啟動子調控人胰島素cdna轉錄獲得初步結果。在胰腺特異性啟動子調控下gk基因可在att 20表達，用表達載體轉染後則表現出葡萄糖刺激的胰島素釋放[6]。正常的葡萄糖感應不僅需 要表達glut2，而且需要類似於正常β細胞的gk/hk活性比值[7]。最近有學者將胰島素原表達 載體直接導入nod小鼠的垂體間葉pomc分泌細胞，能大量分泌成熟胰島素，而這些細胞不受針 對胰島細胞的自身免疫破壞，將一定量的構建細胞移植於nod糖尿病小鼠，高血糖及糖尿病症 狀完全恢復，與胰島細胞自體移植相比，顯示分泌活性更高，再血管化更明顯[8]。 1.4 肝細胞     
經基因工程構建的外源型細胞株用於ⅰ型糖尿病存在各種障礙，已促使許多研究著眼於 內源性細胞。除胰島細胞外肝細胞是含有葡萄糖感應器（glut2及gk）唯一的體細胞，許多肝 髒特異性基因受生理性葡萄糖調控，故作為ⅰ型糖尿病基因治療的靶細胞尤為引人關注。然而 肝細胞不具備有葡萄糖控制胞吐作用的分泌顆粒，也無貯存分泌性蛋白的隔離區。當血糖升高 時，不會出現早相胰島素分泌。肝細胞也不具有切除c肽所需的激素原轉化酶（pc2和pc3）， 故不能加工胰島素原分子[9]。因而，針對肝細胞作為分泌胰島素細胞存在上述缺陷，有關研 究不斷深入。valera在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（pepck）基因調控區控制下，得到表達人胰 島素原基因的轉基因小鼠，從肝細胞分泌的胰島素原具有生物活性，該動物呈現血糖正常且健 康善良好，經鏈脲佐菌素（stz）處理轉基因小鼠後，胰島素mrna水平較stz處理的非轉基因的 對照鼠增加，且血中c肽增加，血糖水平下降達40%[10]。     
    此外，肝腫瘤細胞亦可作為胰島素表達載體轉染的候選細胞，gros等將融合胰島素基因 構建於哺乳細胞的表達載體，其中含有人胰島素原基因（含有費林蛋白內切酶切點）及pepck 基因的啟動子片段，再轉染到大鼠肝腫瘤細胞，後經northern印跡、免疫組化及hplc分析顯示 90%胰島素原被加工成胰島素。胰島素分泌反應快速，經二丙基camp+地塞米松誘導15分鐘，胰 島素分泌量明顯增加，1小時內增加10倍，表現為內源性pepck基因表達受抑及葡萄糖攝取增加 [11]。若同時將人glut2基因轉染肝腫瘤細胞，胰島素分泌可受葡萄糖濃度調控[12]。 
    1.5 成纖維細胞及其它細胞     
    taniguchi用人胰島素原cdna轉染成纖維細胞（ltk細胞），人胰島素原分泌量達91ng/2 4小時/106細胞。這些細胞經半透膜（5%瓊脂糖膠）微囊化，體外研究顯示2×106微囊化的轉 染細胞能穩定產生胰島素原80余天（204.4±5.2ng/ml/天），若種植於stz糖尿病小鼠腹腔內 ，血糖恢復正常達30天[13]。另外，將表達胰島素原的質粒轉染成肌細胞，約50%胰島素原轉 化為胰島素，其分泌功能持續達1個月[14]。kuzume用胰島素原基因構建的腺病毒載體轉染到 293細胞，再植入胰腺全切的狗體內，與定期注射胰島素組相比，血糖維持正常且生存期明顯 延長，即使口服15g葡萄糖後血糖仍維持正常[15]。 
    2 細胞因子     
    tgfβ1能降調許多免疫反應，故有學者將表達tgfβ1載體轉染nod小鼠，tgfβ1水平較對 照組增加，遲發型超敏反應受抑制能保護具有自身免疫反應傾向的nod小鼠免於發生胰島炎或 糖尿病，相反轉入干擾素γ的nod小鼠早發糖尿病[16]。此外，血管內皮細胞生長因子（vegf ）與新生血管形成有關，觀察顯示在糖尿病nod小鼠的缺血部位vegf水平下降，以致干擾側枝 循環形成，肌肉注射編碼vegf的腺病毒載體，可使nod糖尿病小鼠的vegf的腺病毒載體，可使 nod糖尿病小鼠的vegf水平及新生血管形成作用恢復正常[17]。 
    3 表達載體     
    腺病毒載體較適合體內基因轉導，其特點是產生的梯度高，能有效地把基因轉導入靜止 期細胞，遺傳信息保持其獨立可避免因插入性突變改變細胞基因型的危險。但可激發細胞免疫 ，甚至可針對導入基因[18]，同時轉入基因表達時間有限，故不適宜ⅰ型糖尿病治療。缺陷型 重組逆轉錄病毒載體導入細胞後具有自我更新的特性，可長期表達。但產生滴度較低，且細胞 需處在增殖期，否則前病毒dna不易整合到染色體dna。     目前正研制新一代組合載體可克服上述不足，該載體是來自不同病毒成份及特性組合體 。woo用逆轉錄病毒將胰島素原基因導入大鼠肝髒，在病毒末端長重復序列的調控下，至少5% ～15%肝細胞被轉染，持續達6個月。若用stz處理大鼠，6天後均死於酸中毒，而在轉導2周後 在用stz處理轉基因大鼠，部分大鼠存活長達3周，但血糖水平類似於對對照鼠。提示來自於肝 細胞表達的胰島素原的活性可以防止肝糖原大量減少，脂肪蓄積及酮體產生，但其轉染效率尚 不能使血糖正常[19]。 
    4. 胰導素原加工的改進     
    正常時胰島素在β細胞分泌顆粒內加工為成熟胰島素需要激素原轉換酶pc2、pc3。但肝 細胞不能有效地加工胰島素原，故產生的胰島素原的生物活性較胰島素低。另有一種富含於肝 細胞的成對鹼性氨基酸蛋白酶（亦稱泛轉換酶或費林蛋白酶，furin），僅能識別鼠類胰島素 原的arg-x-lys-arg序列，不能有效加工導入的人胰島素原。為此，將furin序列引入人胰島素 原cdna的g-c、c-a結合點，再導入肝細胞即可分泌成熟胰島素[20]。因而，有學者將含有fur in識別序列的人胰島素原載體轉基因到小鼠肝髒，經高效液相色譜（hplc）分析顯示胰島素原 能有效地加工成胰島素分子[21]。 
    5 轉化效率     
    首先，page通過改進培養條件或加入肝細胞生長因子（hgf）能使80%小鼠肝細胞及40%人 肝細胞被轉導[22]。其次，亦可改進載體本身，一種組合病毒顆粒含有慢病毒（lentivirus, hiv1)可將前病毒基因組整合到非分裂期細胞內，高滴度制備逆轉錄病毒載體，利用vsv包被蛋 白作為病毒殼蛋白替代env基因產物，可轉導靜止期肝細胞β，極有可能成為ⅰ型糖尿病基因 治療的載體。 
    6 結語     
    綜上所述，要取代ⅰ型糖尿病的注射胰島素治療，移植能分泌具有生物活性胰島素的細 胞將是未來主要方向。然而，對細胞作基因工程以建立一種新型“β細胞”較為復雜，要作為 臨床治療手段，尚需進行許多改進得到更多的臨床驗證，此外，用細胞因子預防ⅰ型糖尿病或 血管並發症的臨床價值尚待探索。在此嶄新領域內治療糖尿病可靠方法能否脫穎而出，取決其 療效、安全、方便及費用。